ICS 67. 180. 10 X 31 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T18932.21—2003 蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法 酶联免疫法 Method for the determination of chloramphenicol residues in honey- Enzyme linked immunosorbent assay method 2004-06-01实施 2003-12-26发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 GB/T 18932.21—2003 前言 GB/118932的本部分的附录A为资料性附录 本部分由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出。 本部分由中华全国供销合作总社归口。 本部分起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局 本部分主要起草人：庞国芳、付宝莲、张进杰、肖艳霞。 本部分系首次发布的国家标准。 GB/T18932.21—2003 蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法 酶联免疫法 1 范围 GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中氯霉素残留量酶联免疫测定方法。 本部分适用于蜂蜜中氯霉素残留量的测定。 本部分的方法检出限：氯霉素为0.30μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注明日期的引用 文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达 成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于 本部分。 GB/T6379测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性 (GB/T6379—1986,neqISO5725:1981) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 试样中残留的氯霉素与试剂盒中的氯霉素酶标记物共同竞争氯霉素抗体，形成有酶标记或无酶标 记的抗原抗体复合物而被吸附于微孔板底。用酶标仪在450nm处测定吸光度，根据吸光度值得出样 品中氯霉素的残留量。 4试剂和材料 4.1氯霉素试剂盒 4.1.196孔板：12条×8孔。 4.1.2氯霉素标准溶液 4.1.3氯霉素酶标记物溶液。 4.1.4氯霉素抗体溶液。 4.1.5酶基质。 4.1.6发色剂。 4.1.7 反应停止液。 4.1.8缓冲溶液。 4.2乙酸乙酯 分析纯，重蒸馏。 4.3水 GB/T6682规定的一级水。 5仪器 5.1酶标仪。 GB/T 18932.21—2003 5.2 洗板机：配8道或12道洗头。 5.3 8道移液器：50μL~300μL。 5.4单道移液器：5μL~50μL，100μL~1000μL和2ml~10mL。 5.5离心机。 5.6氮气吹干仪。 5.710mL具塞试管。 5.8液体混匀器 5.9振荡器。 6试样制备与保存 6. 1 试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的实验室样品，在密闭的情况下，置于不超过 60℃的水浴中温热、振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样 置于样品瓶中，密封，并加以标识。 6.2试样的保存 将样品于室温下保存。 7分析步骤 7.1提取 称取2g试样，精确到0.01g，置于25mL具塞离心管中，加入4mL水和4mL乙酸乙酯（4.2），在 液体混匀器上充分混匀2min，使试样完全溶解。在振荡器上振荡10min，以4000r/min离心10min。 准确吸取上层乙酸乙酯1mL于10mL具塞试管（5.7）中，用氮气吹干仪在50℃吹干。加入0.5mL缓 冲溶液（4.1.8)溶解残渣，供酶标仪测定。此溶液含试样量0.5g，稀释系数为1。 7.2测定条件 以下所有操作应在20℃～24℃室温下进行。 7.2.1酶标仪测定条件：酶标仪测定波长为450nm。 7.2.2洗板条件如下： 7.2.2.1洗板机洗板条件采用条式抽干和注满，洗涤次数八次，每次注水量为250μL～350μL。 7.2.2.2人工洗板条件：洗涤次数五次以上，每次注水量为250μL。 7.2.3氯霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（20℃～24℃后方可使用。氯霉素标准溶液 （4.1.2）、氯霉素酶标记物溶液（4.1.3)和氯霉素抗体溶液（4.1.4）等均按1份试剂+10份缓冲溶液进 行稀释与制备。每次测定所用的稀释液均应现配现用。 7.3测定 测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。 7.3.1分别吸取50μL稀释的酶标记物、氯霉素标准溶液、样品溶液和氯霉素抗体2等按模板图位置， 依次加入各自的微孔底部，然后，用封口膜密封孔条以防溶液挥发。持微孔板在台面上以圆周运动方式 混匀后，于20℃～24℃避光孵育2h3。 1）个别品牌试剂盒中试剂的稀释系数略有不同。 2）个别品牌试剂盒中的试剂加人量略有不同。 3）个别品牌试剂盒的孵育温度与时间略有不同。 2 SAIG GB/T18932.21—2003 7.3.2将微孔架置于洗板机上，按设定的洗板程序洗板后，将微孔架反扣在吸水纸上并反复拍打。此 步骤既要去除微孔中过多的残液，又不能使微孔干燥。 7.3.3迅速加人50μL酶基质和50μL发色剂于微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方 式混勾后，于20℃～24℃避光孵育30min。 7.3.4迅速加人100uL反应停止液于微孔底部。然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将 微孔架置于酶标仪中，在450nm处测量吸光度（加人反应停止液后应在60min内读取吸光度）。 7.4平行试验 SAG 按以上步骤，对同一标准、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 7.5空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 7.6 监控试验 每次测定均应做一个添加氯霉素标准的样品。 8结果计算 在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标（%），氯霉素标准溶液浓度（ug/kg）为横坐标，绘制标准 工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的氯霉素浓度后，结果按式（1)计算： V.1000 X=c .(1) m1000 式中： X——试样中氯霉素残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； 从标准工作曲线上得到的试样中氯霉素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； C V——样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）； m—样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。 结果表示到小数点后两位。 注：计算结果应扣除空白值。 9确证试验 如被测样品中氯霉素残留量的值大于检出限时，应用GC-MS法或LC-MS-MS法进行确证。 10精密度 本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度 来计算。 10.1重复性 在重复性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.300ug/kg～4.050ug/kg范围时，获得的两次独立测 试结果的绝对差值不超过重复性限（r），本部分的重复性限按方程式（2）计算： r=0.0497m+6.6495 .(2) 式中： m——两次测定值的平均值，单位为微克每千克（μg/kg）。 如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。 10.2再现性 3