ICS 65. 120 B 46 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 21037—2007 饲料中三甲氧芒胺嘧啶的测定 高效液相色谱法 Determination of trimethoprim in feeds- High performance liquid chromatography 2007-06-21发布 2007-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21037—2007 前言 本标准是在查阅了国内外大量文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的，采用了高效液相 色谱法检测饲料中三甲氧苄胺嘧啶。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准负责起草单位：中国农业大学、农业部兽药安全监督检验测试中心（北京）。 本标准主要起草人：张素雷、沈建忠、丁双阳、程林丽、李建成 GB/T21037—2007 饲料中三甲氧苄胺嘧啶的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了测定饲料中三甲氧苄胺嘧啶含量的高效液相色谱法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中三甲氧苄胺嘧啶含量的测定。本方法的最低检 测限为1.0mg/kg，最低定量限为2.0mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 3方法原理 用二氯甲烷-乙酸钠溶液提取饲料中的三甲氧苄胺嘧啶，经离心除去固体物及部分杂质后，取下层 有机相适量，氮气吹干后用1%冰乙酸溶液复溶，用正已烷除脂，下层水相经滤膜过滤后用高效液相色 谱紫外检测器检测。 4试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级用水规定 4.1甲醇：色谱纯。 4.2 二氯甲烷。 4.3正已烷。 4.4乙酸钠溶液（82g/L）：取8.2g乙酸钠于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.5乙 乙酸溶液（1%）：取1mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.6 乙酸溶液（0.5%）：取0.5mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.7三甲氧芊胺嘧啶标准贮备液：准确称取三甲氧苄胺嘧啶标准品（含量大于98%）0.100g于 100mL的容量瓶中，用乙酸溶液（4.5）溶解并定容，配制成浓度为1mg/mL的三甲氧胺嘧啶贮备液。 4℃条件下贮藏，有效期三个月。 （4.5）稀释并定容，配制成浓度为100μg/mL的三甲氧苄胺嘧啶标准中间液。4℃条件下贮藏，有效期 二个月。 4.9三甲氧苄胺嘧啶标准工作液：分别移取三甲氧苄胺嘧啶标准中间液（4.8)0.025mL、0.125mL、 0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL5.0μg/mL10.0μg/mL和50.0μg/mL标准工作液。 5仪器和设备 5.1实验室常用仪器、设备。 5.2高效液相色谱仪（配有紫外检测器）。 1 GB/T21037—2007 5.3分析天平：感量为0.0001g。 5.4旋涡混合器。 5.5离心机。 5.6超声波清洗器。 6试样制备 按GB/T14699.1规定，取有代表性的样品1kg，四分法缩减取约200g，经粉碎，全部过孔径 0.45mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1试样提取 称取一定量的试样（配合饲料约2g，浓缩饲料约1g，预混合饲料约1g，准确至0.001g），置于 50mL离心管中，加入10mL乙酸钠溶液（4.4）和20mL二氯甲烷，水浴超声15min，每隔5min涡动 一次，每次涡动1min，3800r/min离心10min。 7.2净化 用10ml注射器吸取10mL的下层二氯甲烷于10mL离心管中，3800r/min离心10min。小心 吸取再次离心过的二氯甲烷提取液2mL于另一个10mL离心管中，40℃下氮气吹干。加人1mL乙酸 溶液（4.5），涡动10s，再加人2mL正已烷，涡动20s，3800r/min离心10min。下层水相用2mL正 已烷重复洗涤一次。经孔径为0.45μm滤膜过滤后用高效液相色谱分析。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱：Cis柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或相当者； 柱温：35℃； 流动相：0.5%乙酸溶液（4.6）+甲醇，75+25（V+V2）； 流速：0.5mL/min； 检测波长：270nm； 进样体积：50μL。 7.3.2液相色谱测定 分别取适量的标准工作液和试样溶液，按7.3.1列出的条件进行液相色谱分析测定。以标准工作 液作单点或多点校准，并用色谱峰面积积分值定量。测定中应注意调整试样溶液的浓度，使三甲氧苄胺 密啶的积分值落在标准曲线的相应范围内，并在试样溶液分析间适当穿插标准工作液，以确保定量的准 确性。所得三甲氧苄胺嘧啶的色谱图见图1。 0. 005 - 0. 004 Fc00'0 0. 002 J 0. 001- 0. 000- -0. 001 - -0. 0021 (uu) 00 37 000z 0081 00 91 00 t1 00 31 00 01,00 8, 00 9, 00 003, 00 ) 图1400ng/mL标准溶液色谱图 2 GB/T 21037—2007 结果计算与表述 8 饲料中三甲氧苄胺嘧啶的含量X，以质量分数（mg/kg）表示，按式（1)计算： c.V.n X=3 m 式中： c——试样液中对应的三甲氧苄胺嘧啶的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)； V一一试样液总体积，单位为毫升（mL）； n稀释倍数； m——饲料样品质量，单位为克（g）。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 精密度 同一实验室由同一操作人员使用同一台仪器完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于15%