ICS 65.020 CCS B 16 湖 DB43 南 省 地 方 标 准 DB43/T 1 9 66—2020 大型溞繁殖毒性试验技术规程 Guideline for Reproduction Test of Daphnia magna Straus 2020-12-29发布 湖南省市场监督管理局 2021-03-29实施 发 布 DB43/T 1966—2020 目 次 前言························································································································ Ⅲ 1 范围 ····················································································································· 1 2 规范性引用文件 ······································································································ 1 3 术语和定义 ············································································································ 1 4 环境条件 ··············································································································· 1 5 仪器设备和器材 ······································································································ 2 6 培养基 ·················································································································· 2 7 试验溶液 ··············································································································· 2 8 受试生物 ··············································································································· 2 9 试验方法 ··············································································································· 3 10 质量保证·············································································································· 4 附录 A（资料性） Elendt M4 培养液和 M7 培养基的制备 ···················································· 5 I DB43/T 1966—2020 II DB43/T 1966—2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020 给出的规则起草。 本文件某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南省植物保护研究所,长沙艾格里生物科技有限公司。 本文件主要起草人：陈昂、刘勇、张德咏、张战泓、罗杰、蒋桂芳、陈武瑛、熊浩、罗香文。 III DB43/T 1966—2020 IV DB43/T 1966—2020 大型溞繁殖毒性试验技术规程 1 范围 本文件规定了大型溞繁殖试验的环境条件、仪器和设备、培养基、试验方法、质量保证与质量控制、 数据处理等。 本文件适用于湖南省实验室内大型溞繁殖毒性试验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 14942 食品容器、包装材料用聚碳酸酯成型卫生标准 GB/T 31270 化学农药环境安全评价试验准则 NY/T 1667 农药登记管理术语 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 亲溞 Parent Animals 试验开始时用于繁殖的雌溞。 3.2 幼溞 Offspring 试验期间亲溞所产的溞。 3.3 死亡 Mortality 溞体不能游动，或轻晃试验容器，15 s 内溞的附肢或后腹部也未见活动。 4 环境条件 4.1 光照 每天光照 16 h，光照强度不超过 1500 lx。 4.2 温度 试验的温度在 18～22 ℃范围内。对于同一个试验，温度变化不得超过 2 ℃。 1 DB43/T 1966—2020 4.3 溶解氧 试验开始与试验期间，溶解氧浓度应大于 3 mg/L。 4.4 pH pH 在 6～9 的范围内。正常情况下，任何一个试验中 pH 值的变化不应大于 1.5 个单位。 4.5 硬度 硬度（以 CaCO3 计）应大于 140 mg/L。 5 仪器设备和器材 试验容器和其它试验溶液接触的器皿应为全玻璃制品，或由其它化学惰性材料制成。试验容器通常 为玻璃烧杯。需要的主要仪器为： a） 溶解氧测定仪； b） 适当的温度控制设备； c） pH 计； d） 水质硬度测定仪； e） 测定水中总有机碳（TOC）或化学需氧量（COD）的设备； f） 光照控制设备以及光度计等。 g） 色谱分析仪、质朴分析仪等 6 培养基 6.1 推荐 Elendt M4 和 M7 培养基（见附录 A） 。 6.2 Elendt M4 和 M7 培养基不能用于含有金属受试物的测试，对于含有金属的供试品，可选择替代培 养基，如不含有 EDTA 的 ASTM 重组水。 7 试验溶液 7.1 不同浓度的试验溶液一般由储备液稀释而成。储备液最好是将供试品加入到试验用水中配制而成。 7.2 若使用溶剂或分散剂助溶，其在培养基中的最终浓度应≤0.1 mg/L。 8 受试生物 8.1 受试生物为大型溞（Daphnia magna Straus） ，保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖处于孤雌生 殖状态，且试验结束时每只存活亲溞所产存活幼溞的平均值≥60 只。 8.2 试验开始时，试验用溞应是出生小于 24 h 的非头胎溞。试验用溞应来源于同一个健康的保种培养， 即未表现任何受胁迫现象（如死亡率高，出现雄溞和冬卵，头胎延迟，体色异常等）。日常培养条件（光 照、温度、培养液、喂食单位体积的动物数量）应当和试验条件一致，如果试验时溞类培养基与日常使 用的培养基不同，试验前最好设置驯养期，一般试验用溞应在试验条件下驯养 3 周（即一代）以避免新 培养基对亲溞产生胁迫作用。 2 DB43/T 1966—2020 9 试验方法 9.1 暴露条件 9.1.1 试验周期 一般为 21 d。 9.1.2 试验负载 9.1.2.1 每个容器一只亲溞，容器中培养液体积为 50～100 mL。 9.1.2.2 尽管允许合并各平行的溶液进行化学分析，有时为了分析测定供试品浓度的需要，需要增加 溶液的体积。若所用体积大于 100 mL，需要增加溞的喂食量以确保有足够的食物。对于流水式试验， 可分成 4 个平行，每组 10 只溞放在一个较大的试验容器中，应记录对于试验设计的任何变化。 9.1.3 曝气 试验期间不能曝气。 9.2 试验生物及喂食 9.2.1 半静态试验 每个供试物浓度处理组及对照组至少 10 只溞并分开培养，最好每天喂食，至少也应每周 3 次（即 更换溶液时） 。 9.2.2 流水式试验 要求每一浓度 40 只溞，分成 4 个平行，每组 10 只。也可减少试验用溞，但至少 20 只，且应该以 相同数量分成两个或多个平行。若有亲溞死亡，就不能计算试验结束时每只存活亲溞的繁殖量。在这种 情况下繁殖量应该以试验开始时存在的每只亲溞所产存活幼溞总数表示。 9.2.3 如果使用替代测定的方法，如藻细胞数量法或光吸收法来计算喂食量，每个实验室都应单独建 立碳含量和替代测定方法的指标之间的线形图。线形图至少每年校准一次。 9.2.4 推荐食物：小球藻（Chlorella sp.）、羊角月牙藻（Pseudokirchneriella subcapitata）和栅藻 （Desmodesmus subspicatus）。喂食量以提供每只亲溞的有机碳数量为基础，应在 0.1～0.2 mg C/ （溞•d）范围内。喂食量在试验期间可保持不变，也可以在初期稍低，随亲溞的生长而逐渐增加，但始 终应在推荐的范围内。应给大型溞喂食浓缩了的藻液，尽量避免过多的藻培养液浸入试验容器。浓缩藻 液可通过离心获得，然后用蒸馏水、去离子水或溞培养液使其重新悬浮。 9.3 试验设计 9.3.1 预实验 按正式试验的条件，设置较大范围浓度系列的试验药液，每个试验浓度组设 2 个平行，对照组不设 平行，以得到正式试验的浓度范围。 9.3.2 正实验 在预实验确定的浓度范围内按一定比例间距（极差应控制在 3.2 倍以内）设置至少 5 个浓度组，并 3 DB43/T 1966—2020 设立空白对照组，如使用溶剂助溶还应设溶剂对照组。 9.3.3 限度试验 设置上限浓度 10 mg/L，浓度组和对照组均设 10 个平行。若供试物溶解度小于 10 mg/L，则采用最 大溶解度作为上限浓度。 9.3.4 参比物质实验 应定期（至少每年一次）进行参比物质试验，参比物质为重铬酸钾。 9.4 培养基更换频率 半静态试验中，每周至少更换 3 次溶液，若供试品不稳定，应考虑增加更换频率，或使用流水