ICS 65.020 CCS B 16 湖 43 南 省 地 方 标 准 DB43/T 2008—2021 茄子抗青枯病鉴定技术规程 Regulation for evaluation of eggplant resistance to Bacterial wilt 2021 - 05 - 20 实施 2021 - 02 - 20 发布 湖南省市场监督管理局 发 布 DB43/T 2008—2021 目 次 前言························································································································ Ⅲ 1 范围 ····················································································································· 1 2 规范性引用文件 ······································································································ 1 3 术语和定义 ············································································································ 1 4 接种体制备 ············································································································ 1 5 室内抗性鉴定 ········································································································· 2 6 病情调查 ··············································································································· 3 7 抗病性评价 ············································································································ 4 8 抗性鉴定记载 ········································································································· 4 附录 A（资料性） 茄子抗青枯病鉴定结果记载表格 ························································· 5 I DB43/T 2008—2021 II DB43/T 2008—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖南省农业农村厅提出。 本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：湖南省蔬菜研究所。 本文件主要起草人：杨建国、汪端华、吴双花、李倩、王鑫、皮向红、宋志伟。 III DB43/T 2008—2021 IV DB43/T 2008—2021 茄子抗青枯病鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了茄子青枯病鉴定的术语和定义、接种体制备、室内抗性鉴定、病情调查、抗病性评价 以及抗性鉴定记载等要求。 本文件适用于湖南地区茄子青枯病抗性鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有引用规范性文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 茄子青枯病 Bacterial wilt 由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的土传病害，细菌性病害，发病初期茄子个别 枝条的一片或几片叶片局部萎垂，后症状逐渐扩展到整株枝条上，发病轻的植株白天萎蔫，日落或早晨 恢复正常。发病叶片初呈淡绿色，后变褐焦枯，病叶脱落或残留在枝条上；发病枝条髓部大多腐烂空心， 维管束呈黄色或褐色，髓部和皮层组织也变色，用手挤压病茎的横切面有乳白色粘液渗出，病果表面正 常，内部变褐色，后期病果呈水渍状，易脱落。 3.2 病原分离物 Pathogenic isolate 采用人工方法从植株发病部位分离获得病原物的纯培养物。 3.3 致病性 Pathogenicity 病原物所具有的破坏寄主植物和引起病变的能力。 3.4 人工接种 Artificial inoculation 在适宜条件下，通过人工操作将接种体置于植物体的适当部位并使之发病的过程。 4 接种体制备 4.1 病原物的分离与鉴定 采集自然发病的田间植株，在超净工作台中，将发病茎段在 75％酒精中浸泡 90s，灭菌水清洗 2 次～3 次，再放入 0.2％ 次氯酸钠（Naclo）中浸泡 3 min～5 min，灭菌水清洗 2 次～3 次，用灭菌滤 纸吸干茎段表面的水分，并将茎段切开，然后放入少量灭菌水中浸泡 10 min，待看到明显的菌液渗出， 1 DB43/T 2008—2021 吸取细菌粗悬液，涂布在 TZC（氯化三苯四氮唑）固体选择性培养基上，放入 30 ℃恒温箱中培养 48 h， 用灭菌的牙签挑单个红色菌落，接种至 TZC 液体培养基中后，放入 30 ℃摇床培养 48 h，用细菌提取试 剂盒提取菌液 DNA，利用 PCR（聚合酶链式反应）技术扩增青枯菌特异片段，并进行测序鉴定（青枯菌 鉴定引物见表 1） 。 表 1 青枯菌鉴定特异引物 引物名称 引物序列 正向引物 GTCGCCGTCAACTCACTTTCC 反向引物 GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG 目的片段长度 退火温度 280bp 60℃ 4.2 病原物的繁殖 4.2.1 病原物的繁殖 将青枯菌菌液吸取 10μL～20μL 涂布或划线于 TZC 固体选择性培养基上，放入 30 ℃恒温箱中倒 置培养 48h。用灭菌的牙签挑单个菌落，接种 TZC 液体培养基中后，放入 30 ℃摇床进行培养。 4.2.2 TZC 选择性培养基的配制 现配现用，3 g 蔗糖，5 g～10 g 蛋白胨，3 g 牛肉浸膏，7 g 琼脂粉，加蒸馏水定容至 1000 ml， 调 pH 值至 7.0，高温灭菌后加入 0.05％的氯化三苯四氮唑。 4.3 接种体的制备 将增殖培养的病原菌液用无菌水稀释，用紫外分光光度计在波长 600 nm 处测定病菌浓度，将菌液 8 浓度调制成为 10 cfu/mL（OD600=0.1）悬浊液。 5 室内抗性鉴定 5.1 鉴定室 人工接种鉴定室应具备人工调节温度、湿度和光照的条件，使人工接种后具备良好的发病环境。 5.2 鉴定设计 鉴定材料顺序或者随机排列，每份材料重复 3 次，每一重复 10 株苗。 5.3 鉴定材料准备 待鉴定的种子先在 2％的 NaClo 溶液中浸种 8 min ～10min，用灭菌水冲洗干净后置于 28℃的恒温 培养箱中催芽，露白后播种于育苗钵内。育苗基质为草木灰（或草炭） 、蛭石、菜地土以 2∶1∶1 的比 例混合（或沙性土壤与草炭以 3∶2 的比例混匀），并经高温蒸汽灭菌（134℃，40min），在温室或大棚 里育苗，温室或大棚的温度控制在 25±2℃。幼苗应生长健壮、大小一致。 5.4 接种 5.4.1 接种期 5 片～6 片真叶进行接种。 2 DB43/T 2008—2021 5.4.2 接种体浓度 8 接种浓度 10 cfu/mL。 5.4.3 接种方法 采用伤根--蘸根法进行人工接种，先用刀将植株根部切伤，再将 50mL 菌液倒入营养钵中。 5.4.4 接种后的管理 每天浇水 1 次～2 次保持土壤湿润，保持白天温度为 30±2℃，夜间为 28±2℃，相对湿度（RH） ＞95％。 6 病情调查 6.1 调查时间 接种后 7 d～15 d 调查病情。 6.2 病情级别划分 病情级别及其相对应的症状描述（见表 2）。 表 2 茄子抗青枯病室内鉴定病情级别的划分 病情级别 病情描述 0 全叶无叶片感病 1 0.5 片～1 片叶失水萎焉状 2 2 片～3 片叶片枯萎 3 3 片以上叶片枯萎 4 全部叶片枯萎死亡 6.3 调查方法 调查每份鉴定材料接种病原物后的发病情况，依据病害症状描述，逐份调查和登记病情级别，计算 出病情指数（DI） 。病情指数的计算见公式（1）计算。 病情指数计算公式 1： DI  ∑( s ×n)  100…………………………………………………（1） N S 公式中: DI ——病情指数； s ——各病情级别的代表数值； n ——各病情级别的植株数； N ——调查总植株数； S ——最高病情级别的代表数值； 3 DB43/T 2008—2021 7 抗病性评价 7.1 抗病性评价标准 根据病情指数（DI）确定其抗性水平，划分标准（见表 3） 。 表 3 茄子抗青枯病鉴定的评价标准 病情指数（DI） 抗性评价 DI = 0 免疫（I） 0 ＜ DI ≤ 20 高抗（HR） 20 ＜ DI ≤ 40 抗病（R） 40 ＜ DI ≤ 60 中抗（MR） 60 ＜ DI ≤ 80 感病（S） DI ＞ 90 高感（HS） 7.2 鉴定结果的有效性判别 当感病对照材料达到其相应感病程度（DI＞50），该批次的抗青枯病鉴定即为有效。 8 抗性鉴定记载 茄子抗青枯病鉴定结果记载（见附录 A） 。 4 DB43/T 2008—2021 附 录 A （资料性） 茄子抗青枯病鉴定结果记载 表 A1 茄子抗青枯病鉴定结果记载表 编号 品种 名称 重复 区号 病情级别 病情指数 0 1 2 3 4 A B C 评价病指 抗性评价 播种日期 接种日期 病原分离物编号 病原物接种浓度 调查日期 调查人员 5