ICS 65.020.20 CCS B 16 33 浙 江 省 地 方 标 准 DB33/T 2408—2021 甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Dickeya dadantii 2021 - 12 - 24 发布 2022 - 01 - 24 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 DB33/T 2408—2021 前 言 本标准按GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省植保检疫与农药管理总站、浙江大学、浙江省植物保护学会。 本标准主要起草人：楼兵干、李艳敏、沈肖玲、陆剑飞、施海萍、高其康、李国钧、张莉丽、李月 红、刘丽华、仇智灵、姚海峰、王荣洲。 I DB33/T 2408—2021 甘薯茎腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了术语与定义、缩略语、甘薯茎腐病菌PCR反应和实时荧光PCR反应体系的构成、试剂和 材料、器材与设备、操作步骤和结果判定。 本标准适用于甘薯根、茎、叶等植物材料甘薯茎腐病菌的检测。 2 规范性引用文件 本标准没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 甘薯茎腐病菌 the pathogen of stem and root rot of sweet potato 引起甘薯茎腐病的病原菌，属于细菌界（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、伽玛变形菌 纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacterales）、果胶杆菌科（Pectobacteriaceae）、 狄克氏菌属（Dickeya）、达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)。革兰氏阴性细菌，菌体短杆状，大小 约为2.36 μm× 0.40 μm，周生鞭毛，可在烟草上激发过敏性反应（HR）。 注： 症状特征见附录A。 4 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 bp：碱基对（Base pair） CFU：菌落形成单位（Colony-Forming Unit） CTAB：溴代十六烷基三甲胺（Cetyltrimethylammonium bromide） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate） HR：过敏性反应(Hypersensitive Reaction) MALDI-TOF MS ： 软 电 离 高 分 辨 飞 行 时 间 串 联 质 谱 仪 （ Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry） NA：营养琼脂（Nutrient Agar） NGM：营养琼脂甘油培养基（Nutrient Agar Glycerol Media） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction） Taq：水生噬热杆菌（Thermus aquaticus） 1 DB33/T 2408—2021 5 方法原理 根据甘薯茎腐病的菌落形态特征、田间危害症状特征、分子生物学PCR或RT-PCR反应特征、蛋白质 指纹图谱特征和致病性测试结果等进行检测鉴定。 6 试剂或材料 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 75 %乙醇。 1 %次氯酸钠。 蛋白胨。 牛肉浸膏。 氯化钠。 琼脂粉。 蔗糖。 NA、NGM 培养基配方，培养基配比按附录 B 执行。 PCR 凝胶电泳检测试剂，制备方法按附录 C 执行。 实时荧光 PCR 检测试剂，制备方法按附录 D 执行。 7 仪器设备 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12 7.13 7.14 7.15 7.16 7.17 7.18 普通冰箱。 超低温冰箱：最低可设定温度-80 ℃。 台式小型离心机。 低温高速离心机。 PCR 仪。 实时荧光定量 PCR 仪。 电泳仪。 水平电泳槽。 凝胶成像分析仪。 微波炉。 电子天平：最小分度值为 1 mg。 显微镜。 恒温培养箱。 超净工作台。 灭菌锅。 旋涡振荡器。 移液器。 MALDI 质谱仪：需具有细菌鉴定分析模块及含 D.dadantii 质谱数据的菌株数据库。 8 甘薯茎腐病菌检测流程 2 DB33/T 2408—2021 甘薯茎腐病菌检测流程图见图1。 图1 甘薯茎腐病菌检测流程图 9 症状观察 对于植株样品，参见附录A中的症状描述观察有无甘薯茎腐病典型症状，对出现典型症状或可疑症 状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的块根、藤蔓、叶柄、叶片等进行检测，无症状植株随机取样 测试。 10 实验室检测 10.1 样品处理 10.1.1 对于有症样品：取病健交界处组织置于低倍显微镜下观察有无喷菌现象（见附录 A）。如观察 到喷菌现象，剪取病健交界处 3 块～5 块组织，每块约 10 mm× 10 mm，表面消毒后无菌水洗三次，剪碎 后加入 1 mL 生理盐水，室温浸泡 15 min～30 min 或 4 ℃冰箱 8 h 以上，取浸泡液 12 000 r/min（离心力 10 000 g）离心 5 min，1 mL 无菌水悬浮沉淀，用于 PCR 检测或直接平板划线进行病菌分离培养，28 ℃ 培养 2 d～3 d，获得单菌落。 10.1.2 对于无症样品：取 10 块～20 块植物材料剪碎，100 mL～200 mL 生理盐水 4 ℃冰箱过夜，浸泡 液 10 000 r/min（离心力 9 000 g）离心 20 min，1 mL 无菌水悬浮沉淀；12 000 r/min（离心力 10 000 g） 离心 5 min，沉淀用于提取 DNA 和 PCR 检测；如 PCR 检测为阳性，将上述检测样品表面消毒，无菌水洗 三次后，加入 100 mL 生理盐水，室温浸泡 1 h 或 4 ℃冰箱 8 h 以上，浸泡液 10 000 r/min（9 000 g）离 心 20 min，1 mL 无菌水悬浮沉淀，悬浮液稀释 2 个～3 个梯度，于 NGM 或 NA 平板涂布 3 个～5 个平板分 3 DB33/T 2408—2021 离，28 ℃培养 2 d～3 d。 10.1.3 分离培养鉴定：用灭菌接种环蘸取样品悬浮液在 NGM 或 NA 平板上划线分离，同时，将悬浮液 进行 10 倍梯度稀释 3 次，各取 100 μL 稀释液涂布培养皿，重复 3 次，28 ℃恒温培养 2 d，挑取疑似甘 薯茎腐病菌单菌落进行转接纯化， 菌落形态特征见附录 A，再采用本标准 10.2 或 10.3 方法进一步鉴定。 NGM 和 NA 培养基的配方按附录 B 执行。 10.2 PCR 检测 10.2.1 模板制备 样品DNA的提取可按CTAB方法，也可使用商品化的DNA提取试剂盒提取。提取的核酸用于PCR检测或 -20 ℃保存备用。 10.2.2 常规 PCR 检测 对于有症样品，以标准菌株做阳性对照，健康植物组织做阴性对照，双蒸水作为空白对照进行PCR 检测，具体检测步骤和判定标准按附录C执行。单菌落可制成菌悬液直接进行PCR检测。 10.2.3 实时荧光 PCR 检测 检测步骤按附录D执行，对照设置按本标准10.2.2执行。单菌落可制成菌悬液直接进行实时荧光PCR 检测。 10.3 MALDI-TOF 质谱鉴定 单菌落按MALDI-TOF MS质谱进行检测，具体鉴定步骤和判定标准按附录E执行。 10.4 致病性测试（可选） 8 挑取疑似甘薯茎腐病菌单菌落制成10 CFU/mL菌悬液，用针刺接种方法对甘薯藤蔓进行致病性测试。 对照为无菌水接种，保湿1 d，25 ℃～30 ℃，12 h/12 h生长。接种2 d～4 d后观察接种位置附近是否出 现症状。根据柯赫氏法则，对发病处组织再分离病菌，分离单菌落进行PCR检测，完成验证。 11 结果判定 对于有症状样品，PCR检测结果为阳性，即判定为检出甘薯茎腐病菌；无症状样品或新发生区的有 症状样品，PCR检测结果阳性，且分离到病菌，参考致病性测试结果，判定检出甘薯茎腐病菌。其中， PCR检测可根据实验条件，选择本标准10.2.2或10.2.3的一种进行检测，任意一种检测方法的结果为阳 性则判定为PCR检测结果为阳性。分离的疑似甘薯茎腐病菌单菌落鉴定可选用本标准10.2.2或10.2.3或 10.3中的一种进行检测，任意一种检测方法的结果为阳性则判定结果为阳性，即分离的单菌落鉴定为甘 薯茎腐病菌D.dadantii。 12 样品及检测结果保存 12.1 样品保存与处理 4 DB33/T 2408—2021 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出甘薯茎腐病的样品应妥善保存，以备复核。该类样品 保存期满后应经高压灭菌处理。 12.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为甘薯茎腐病菌的菌株，可采用甘油保存或冻干保存，对不需要长期保存 的菌株应及时灭菌处理。 12.3 结果记录与资料保存 实验记录包括：样本来源、采样时间、采样地点、品种、样本的具体症状特点、送样时间、送样人、 送样人联系方式和联系地址、检测时间、地点、方法和鉴定者。疑似症状等应及时拍照保存，PCR检测 结果需有原始实验数据及相关结果图片。 5 DB33/T 2408—2021 附 录 A （资料性） 甘薯茎腐病菌基本信息 A.1 症状 在甘薯苗期、生长期至贮藏期均可发生，可为害薯块、薯苗、藤蔓、叶柄和叶片。植株早期发病， 叶片萎蔫，茎部、叶柄出现暗褐色至黑褐色软腐，维管束黑褐色，叶脉有变黑坏死的现象发生，叶片上 出现黑褐色斑，见图A.1。早期发病全株枯死。中后期发病，在病斑部位上端的藤蔓有不定根深入土中 吸取营养而使植株“假健康”，到收获时发现藤蔓基部腐烂变成纤维状，薯块变黑腐烂。贮藏期薯块初 发病斑一般以芽眼为中心圆形，稍凹陷，黑褐色，后逐渐扩大引起整薯腐烂，病部软化腐烂有臭味。 图A.1 甘薯茎腐病症状 A.2 病原菌形态及培养性状 病原菌是革兰氏阴性细菌，菌体短杆状，大小约为2.36 μm×0.4 μm，周生鞭毛，见图A.2。可在 烟草上激发过敏性反应（HR），见图