ICS 65.020 B 16 江 DB36 西 省 地 方 标 准 DB36/T 1526—2021 山药主要病原线虫鉴定技术规程 Technical regulation for identification of the main pathogenic nematode of Chinese yam 2021 - 12 - 14 发布 江西省市场监督管理局 2022 - 06 - 01 实施 发 布 DB36/T 1526—2021 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 符号 .............................................................................. 1 5 设备和试剂 ........................................................................ 2 6 样品采集与分离 .................................................................... 2 7 形态学鉴定 ........................................................................ 2 8 分子鉴定 .......................................................................... 4 附录 A（规范性） 线虫玻片标本制作方法 ................................................ 6 附录 B（规范性） 山药主要病原线虫形态特征图 .......................................... 8 附录 C（规范性） 山药主要病原线虫分子鉴定系统发育树 ................................. 10 I DB36/T 1526—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院农业应用微生物研究所、吉安市农业科学研究所、吉安市永丰 县蔬菜产业发展中心、吉安市泰和县塘洲镇人民政府。 本文件主要起草人：范琳娟、徐雪亮、刘子荣、喻吉生、涂年生、康宏波、胡平华、姚英娟。 II DB36/T 1526—2021 山药主要病原线虫鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了山药主要病原线虫南方根结线虫和咖啡短体线虫的术语和定义、符号、设备及试剂、 样品采集与分离、形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法。 本文件适用于山药等块茎类植物根部和土壤及栽培介质中的南方根结线虫和咖啡短体线虫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 南方根结线虫 Meloidogyne incognita (Kofold&White, 1919) Chitwood, 1949 中文名：南方根结线虫 分类地位：线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、垫刃目（Tylenchida）、异皮科(Heteroderidae)， 根结线虫属(Meloidogyne)。 南方根结线虫幼虫属于移动性内寄生，雌虫为固定内寄生。寄主范围很广，通常可危害几百种植物， 主要发生在植物根部，其中侧根和须根最易受害。受害根系常形成大小和形状不同的瘤状根结，使植物 根系吸收、输送养分和水分的能力降低；地上部表现为营养不良，矮化、瘦弱、生长缓慢。 3.2 咖啡短体线虫 Pratylenchus coffeae (Zimmermann, 1898) Filipjev& Schuurmans Steckhven, 1941 中文名：咖啡短体线虫 分类地位：线虫门（Nematoda） 、侧尾腺纲（Secernentea） 、垫刃目（Tylenchida） 、短体科(Pratylenchidae)， 短体线虫属（Pratylenchus） 咖啡短体线虫属于三类检疫性线虫，属多食性的植物寄生线虫，可寄生250多种植物，主要农作物 寄主包括山药、马铃薯、芋头、玉米和姜等，在我国多个省份均有广泛分布。其属于寄主根系皮层的迁 移性内寄生线虫，受害根系常出现褐色病斑，伴随次生病原物，引起根部腐烂，发生严重会引起植株死 亡。 4 符号 L—虫体体长（μm或mm）； 1 DB36/T 1526—2021 a—体长/最大体宽； b—体长/虫体前端至食道与肠连接处的距离； b’—体长/虫体前端至食道腺末端的距离； c—体长/尾长； St—口针长度（μm）； T—泄殖腔开口至精巢末端的距离×100/体长； V—虫体前端至阴门的距离×100/体长； tail—尾长（μm）； DEGO—背食道腺开口至口针基部球距离（μm）。 5 设备和试剂 5.1 主要设备 生物显微镜、体视显微镜具投射光源、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机（2000 rmp以上）。 5.2 主要试剂 5.2.1 形态学鉴定用试剂 指甲油、4%甲醛、甘油、乳酚油（苯酚20 mL、乳酸20 mL、甘油40 mL和蒸馏水20 mL混合而成）、 石蜡、95%酒精。 5.2.2 分子生物学鉴定用试剂 单条线虫DNA提取裂解液、灭菌ddH2O、琼脂糖、1×TAE、蛋白酶K、Prime STAR Max premix(2×)、 Premix Taq(Ex Taq version 2.0 plus dye)、Goldview核酸染料、100 bpDNA ladder marker、DNA克隆试剂 盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞。 6 样品采集与分离 6.1 外观症状检查 对待检测植物样品根及根茎部分进行检查，查看是否有根结或根腐症状，收集上述可疑植物材料及 其根际土壤，一并带回实验室检验。 6.2 线虫分离 对采集到的可疑植物材料，轻轻在自来水下冲洗干净表面，削取 1mm～2 mm 表皮后，切碎剩余的 植物材料，用贝尔曼漏斗法分离表皮和植物中的线虫。 7 形态学鉴定 7.1 南方根结线虫形态鉴定特征 雌虫：虫体膨大呈梨形，白色或乳白色，体前部延伸如颈状，唇区稍凸起，略呈帽状，口针强大。 会阴花纹背弓高、近方形，有平滑到波浪状的线纹组成，侧线不明显，侧线处线纹有分叉，有些线纹弯 向阴门。 2 DB36/T 1526—2021 雄虫：体形细长，蠕虫状，侧区通常有4条侧线。头部常具有2～3条不完整环纹，头冠高且宽，有 一中部凹陷的唇盘。口针强大，发育良好，长23μm～25μm，基部球明显，背食道腺开口距口针基部球 距离较近，约2μm～4μm，尾部端圆，无交合伞。交合刺长35 μm 二龄幼虫：头冠明显，口针纤细，基部球较小，呈圆形，中食道球椭圆形，瓣门明显，有明显的尾 透明区，尾端有缢缩，尾部末端尖圆或钝圆，热杀死后体形向腹部弯曲呈C形，透明尾长6 μm～13.5 μm。 具体玻片制作方法和形态特征图分别详见附录 A 和附录 B.1。 7.2 南方根结线虫测计值 7.2.1 雌虫 L(20)=500 μm～723(609) μm；体宽=331μm～520(415) μm；口针基部球宽度(10)=3 μm～5(4) μm； St(10)=13 μm ～16(14) μm；DEGO(8)=2 μm～4(3) μm；中食道球长度（10）=37 μm～63(46) μm；中食 道球宽度（10）=31 μm～49(39) μm (Whitehead, 1968)。 7.2.2 雄虫 L(14)=1108 μm～1953(1583) μm；a=31.4～55.4(46.3)；St(13)=-23 μm～32.7(25) μm；DEGO(4)=1.4 μm～2.5(2.1) μm；b’(12)=13.8～20.5(17.4)；c(13)=97～255(146)；中食道球长度(12)=14.4 μm～25.2(20) μm；中食道球宽度(12)=8.6 μm～15.8(11.2) μm；交合刺长度(12)=28.8 μm～40.3(35.2) μm；引带长度（7） =9.4 μm～13.7(11.2) μm (Whitehead, 1968)。 7.2.3 二龄幼虫 L=337 μm ～403(371) μm；a=24.9～31.5(28.3)；b(21)=2.02～3.14(2.36)；b’(24)=6.4～8.4(7.1)；tail=38 μm～55(46) μm；c=6.9～10.6(8.1)；St=9.6 μm～11.7(10.5) μm；中食道球长度(24)=10.1 μm～12.9(11.3) μm； 中食道球宽度(24)=5.8 μm～8.3(7.3) μm (Whitehead, 1968)。 7.3 咖啡短体线虫形态鉴定特征 雌虫：虫体粗胖，环纹明显，侧区通常有4条刻线。温热杀死后虫体伸直或呈C形，头骨架发达， 唇区较平，略有缢缩，口针短粗，基部球圆至椭圆形；中食道球近似卵圆形，肠的前端被食道腺从腹面 和侧面覆盖，覆盖长度约为体宽的1～3倍；排泄孔位于食道-肠瓣门的前方，半月体紧靠排泄孔的前部； 卵母细胞单行排列，前端直或有回折，受精囊大，宽卵圆形至圆形；幼龄雌虫尾长约为肛门处体宽的2～ 2.5倍，老熟雌虫尾长约为体宽的1.5～2倍；尾部宽圆或平截，侧尾腺孔小，位于尾部的中前部。 雄虫：口针基部球较雌虫窄，交合刺细长、成对，位于肛门到尾端处，引带4～6 μm，其他特征与 雌虫相似。 具体玻片制作方法和形态特征图分别详见附录 A 和附录 B.2。 7.4