ICS 65.020.01 B 16 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 1007—2020 茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技 术规程 Technical regulation of detection for tomato yellow leaf curl virus carried by seeds and seedlings of solanum fruit vegetables 2020 - 12 - 17 发布 天津市市场监督管理委员会 2021 - 01 - 16 实施 发 布 DB12/T 1007—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市植物保护研究所。 本标准主要起草人：王勇、高苇、张春祥、杨利娟、刘晓琳、霍建飞、姚玉荣。 I DB12/T 1007—2020 茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒检测的仪器和试剂、检测程序、结果判定、样品和 菌株保存。 本标准适用于农业生产中，茄果类蔬菜种苗番茄黄化曲叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 番茄黄化曲叶病毒 tomato yeLLow leaf curl virus（TYLCV） 番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒，因该属病毒在自然条件下只能由烟粉 虱以持久方式传播，又被称为粉虱传双生病毒，是一类具有孪生颗粒形态的植物DNA病毒，广泛分布于 热带和亚热带地区，在烟草、番茄、南瓜、木薯、棉花等重要经济作物上造成毁灭性危害。番茄黄化曲 叶病毒病基本信息参见附录A。 3.2 种苗传播病害 seedling-borne disease 种苗携带病原菌进行传播的一类植物病害。 4 仪器和试剂 4.1 仪器 高速离心机、灭菌锅、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、旋涡振荡器、分析天平（感量1/10000g）。 4.2 试剂 4.2.1 总体要求 除另有规定外，所有试剂均为分析纯试剂，实验用水符合GB/T 6682。 4.2.2 PBS 缓冲液 NaCL 8.10 g、NaH2PO4 0.18 g、Na2HPO4 1.97 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.4。 1 DB12/T 1007—2020 4.2.3 商用植物 DNA 提取试剂盒或 DNA 提取试剂 DNA提取试剂主要有Lysis缓冲液和乙酸钾缓冲液。 4.2.4 裂解缓冲液 100mM Tris-HCL pH 8.0；50mM EDTA，pH8.0；1%SDS；10μg/mL RNase A。 4.2.5 乙酸钾缓冲液 乙酸钾缓冲液3.0M，pH5.5。 4.2.6 凝胶电泳试剂 琼脂糖，TAE Buffer，核酸染料GoLdenview。 4.2.7 PCR 试剂 Master Mix。 5 测试程序 5.1 检测样品 应以种子来源、育苗时间和育苗地点等相同的同一品种的种苗为一个种苗批次，每个种苗批不得大 于1万株，如果该批种苗标记或能明显地看出该批种苗在形态或文件记录上有异质性的证据时，应拒绝 取样。对一批种苗进行抽取样品时，按对角线五点、棋盘式或分层取样，每点取样10株～20株，取样应 有代表性。 5.2 检测方法 5.2.1 样品的制备 将种苗样品均匀剪取植株茎尖和新叶幼嫩组织，加入石英砂后于低温条件下充分研磨，获得研磨组 织物。 5.2.2 DNA 的提取 病毒DNA的提取可以采用商用植物DNA提取试剂盒或DNA提取试剂，按照提取步骤和方法进行，或者 采用如下标准方法进行： ——从研磨组织物中收集 20mg～100mg 研磨组织，放置于 1.5mL 的离心管内（已经加入 0.65mL 的 Lysis 缓冲液），搅拌均匀。每个离心管震荡 30s，然后离心 2min（12000rpm/min）； ——将 0.5mL 上清液转入一个新离心管中，加入 100μL 乙酸钾缓冲液（3.0M，pH5.5）。将离心管 反复倒置几次充分混匀后，再离心 2min（12000rpm/min）； ——取 0.5mL 上清液转入一个新的离心管中（内含 0.5mL 异丙醇），将管内液体充分振荡后，离心 5min（12000rpm/min）。去除上清液后加入 0.75mL 的 70%乙醇溶液，振荡后离心 30s 后去除 上清液，此步骤重复 3 次。最后去除上清液后，为 DNA 样品，将其置于无菌、通风干燥处 30min 以上，让样品干燥后。将 DNA 溶解于 10μL～200μL ddH2O 中。 5.2.3 PCR 检测步骤 2 DB12/T 1007—2020 对检测样本进行PCR检测，检测方法见附录B。采用番茄黄化曲叶病毒标准带毒组织DNA为阳性对照， 采用健康组织DNA为阴性对照，用灭菌ddH2O为空白对照，每样本重复3次。 5.2.4 PCR 产物序列分析 对种苗组织DNA进行PCR扩增，目的扩增片段为543bp，可对扩增产物双向测序，与GenBank中TYLCV 和GenBank中相关序列进行序列相似性比对分析，以验证样品种苗组织研磨物检测结果的准确性。 6 结果判定 番茄黄化曲叶病毒的PCR检验结果判定的方法见附录B： ——检验结果为阴性，可报告为未检出番茄黄化曲叶病毒。 ——检验结果为阳性，可报告为检出番茄黄化曲叶病毒。并可进行 PCR 产物序列分析，对结果进行 确认。 7 样品保存 茄果类蔬菜种苗样品可以其植株、幼嫩组织或DNA的形式保存，该样品需经登记后保存。番茄黄化 曲叶病毒的样品应于零下80℃保存，保存期为1年。 3 DB12/T 1007—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 番茄黄化曲叶病毒 番 茄 黄 化 曲 叶 病 毒 （ Tomato YeLLow Leaf CurL Virus ） 简 称 TYLCV 或 TY ， 隶 属 双 生 病 毒 科 （Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA 病毒。 TYLCV主要为害番茄，并可侵染辣椒、茄子等茄果类蔬菜，症状见图A.1，染病初期植株生长迟缓或 停滞，开花延迟，花朵减少，果实减少。植株明显矮化，节间变短，叶片变小、变厚，叶质脆硬，叶片 有凹凸不平的皱缩或变形，向上卷曲，叶片边缘至叶脉区域黄化，叶脉和中脉附近叶色深绿光亮。随着 植株的生长，病情越来越严重，后期主要表现为叶脉变紫色，叶片变形，焦枯，新叶出现黄绿不均斑块， 开花后结果困难，坐果少，果实变小，膨大速度慢，畸形。成熟期的果实转色慢且不均匀，果肉硬，含 水量低，果浆酸，部分果实开裂或表面褐化，失去商品价值。 图A.1 感染 TYLCV 的番茄 4 DB12/T 1007—2020 BB 附 录 B （规范性附录） 番茄黄化曲叶病毒的 PCR 检测方法 B.1 异性引物 检测番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的特异性引物为： ——TYLCV-F：5’- ACGCATGCCTCTAATCCAGTG TA-3’； ——TYLCV-R：5’-CCAATAAGGCGTAAGCGTGTAGAC-3’。 B.2 PCR反应体系（25μL） ： 2x Taq MasterMix 12.5μL，正向和反向引物（10μmoL/L）各1μL，ddH2O 10.5μL，样品DNA 1μL。 B.3 样品处理 分别取1.5μL样品DNA，进行PCR扩增，每样品重复3次。以携带TYLCV植株组织DNA为阳性对照，以ddH2O 为阴性对照。 B.4 PCR反应条件 94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃继续延伸10 min；4℃保持。 B.5 PCR结果判定 扩增后取2μL PCR反应产物在1%的琼脂糖凝胶电泳后，置凝胶成像仪下观察DNA特异性条带。TYLCV 病毒扩增的目的片段长度为543bp（见图B.1）。该引物对只是针对TYLCV的特异区结合，通过PCR反应可 扩增出543bp目的片段，而对于其他的模板DNA则不能扩增出相应的片段。由此，可以根据特异543 bp 片段的有无作为判断是否感染TYLCV的标准。 注：M，DL2000 DNA marker；1，阳性对照；2，阴性对照；3，空白对照；3～5，带毒组织样本。 图B.1 感染 TYLCV 的番茄带毒组织样本特异性扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 _________________________________ 5