ICS 65.020.30 B 38 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 1856—2018 蛤蚧及其伪品 COI 条形码鉴别技术规程 Identification of Gekko gecko Linnaeus and Adulterants Using the COI Barcode 2018-10-20 发布 广西壮族自治区质量技术监督局 2018-11-20 实施 发 布 — DB45/T 1856 2018 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 术语和定义 ........................................................................ 1 3 鉴别程序 .......................................................................... 2 附录 A（规范性附录） 蛤蚧伪品 ........................................................ 3 附录 B（规范性附录） 蛤蚧及其伪品 COI DNA 序列 ........................................ 4 I — DB45/T 1856 2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出。 本标准由广西卫生标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区药用植物园。 本标准主要起草人：徐永莉、李力、闫志刚、张月云、赵成坚、黄勇、谷颖乐。 III — DB45/T 1856 2018 蛤蚧及其伪品 COI 条形码鉴别技术规程 1 范围 本标准规定了蛤蚧（Gekko gecko）及其伪品的COI条形码鉴别的术语和定义、鉴别程序。 本标准适用于广西境内蛤蚧及其伪品COI条形码的鉴别。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 蛤蚧 Gekko gecko Gekko gecko 蛤蚧（ ）属爬行纲Reptilia、有鳞目Squamata、壁虎科Gekkonidae、壁虎属Gekko。蛤 蚧药材为除去内脏的干燥体。包括黑点蛤蚧和红点蛤蚧。 2.2 蛤蚧伪品 Gekko gecko adulterants 市场上当蛤蚧销售和使用的动物。详见附录 A。 2.3 DNA条形码 DNA barcoding 生物体内能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且较短的DNA片段。 2.4 COI 因。 细胞色素c氧化酶亚基I (cytochrome c oxidase subunit I，COI)，线粒体基因组的蛋白质编码基 2.5 COI条形码 COI barcoding 列。 集中存在于动物线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I(COI)特定区段的一段大约有650个碱基的DNA序 2.6 近邻相接法 neighbor-joining method(NJ法) 一种研究DNA而建立亲缘关系的方法，由序列建立支序图或亲缘关系图。 1 — DB45/T 1856 2018 2.7 bp 碱基对。 3 鉴别程序 3.1 鉴别条件 PCR扩增仪、核酸电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像系统、组织基因提取试剂盒、序列比对软件。 3.2 引物序列 LCOI490：5'—GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG—3'。 HCO2198：5'—TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA—3'。 3.3 DNA 的提取 取药材样品，75％乙醇表面消毒，用灭菌手术刀，取样品皮下肌肉约30 mg,剪碎，DNA提取研磨仪 研磨2 min，用组织基因提取试剂盒提取总DNA，提取步骤参见各产品使用说明书。 3.4 PCR 扩增 反应体积为25 μL，所加试剂包括5 U/μL Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)0.5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL， 10 pmol/μL上下游引物各0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Mg 1.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反应在PCR 扩增仪上进行，反应参数为：95℃ 3 min，(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s）×39，72℃ 5 min，4℃ 保存。 2+ 3.5 电泳 将PCR产物5 μL与上扬染料3 μL混合，加入1.5％琼脂糖凝胶的点样孔中，同时设100 bp梯度DNA标准 分子量作为片段大小的标准。100 V电压电泳约40 min。 3.6 成像及分析 将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察窗内，观察分析并成像保存。 3.7 DNA 样品测序 凝胶上出现一条600 bp大小的特异性条带PCR扩增产物用试剂盒对PCR扩增的样品进行纯化，纯化的 步骤参见各产品使用说明书，将检测纯化后的样品进行测序。 3.8 鉴别 将所得序列经计算机拼接辅以人工校对，采用Biast序列相似性搜索比对，蛤蚧COI5’端序列，即 蛤蚧DNA条形码序列，562 bp的长度用于种间水平的分析。蛤蚧同其伪品间的序列差异为6.0％～64.0％， 平均序列差异为35.0％。通过NJ法并利用实验序列和GenBank序列所构建系统聚类树。基于COI序列构建 的NJ树将蛤蚧与伪品区分。 2 AA — DB45/T 1856 2018 附 录 A （规范性附录） 蛤蚧伪品 无蹼壁虎Gekko swinhonis、中国瘰螈Paramesotriton chinensis、多疣壁虎Gekko japonicus、睑 虎 Goniurosaurus lichtenfelderi 、西藏沙蜥 Phrynocephalus theobaldi 、红瘰疣螈 Tylototriton verrucosus、贵州疣螈Tylototriton kweichowensis、喜山岩蜥Laudakia himalayana、变色树蜥Calotes versicolor、青海沙蜥Phrynocephalus vlangalii、山溪鲵Batrachuperus pinchonii、东方蝾螈Cynops orientalis等。 3 — DB45/T 1856 2018 BB 附 录 B （规范性附录） 蛤蚧及其伪品 COI DNA 序列 B.1 蛤蚧Gekko chinensis 562 bp gaattaagtc aaccaggagc actccttgga aacgaccaac tatacaatgt aatcgtaaca gcacacgcat ttgtaataat cttctttata gtgatgcctg ttataatcgg ggggtttggc aattgattag tccccctaat aattggcgca ccggacatag cttttccacg aataaacaac ataagcttct gactgctccc cccagcatta ttcctcctac tagcctccgc gagtgtgga agctggggcgg ggacaggatg aactgtatac cccccactag cagctaatct agcacatgca ggcgcatctg tagacctggc catcttttcc ttacacctag ctggagtctc ttccatctta ggggccatca attttatcac cacctgcatt aatataaaac ccccaagcat aacccaatac acgacacccc tgtttgtatg atcggttcta attactgccg tactacttct cctagcacta ccagtgcttg ccgccggcat cactatactg ctgaccgacc gtaaccttaa cacatcattc tttgaccctg ccggaggcgg gg B.2 无蹼壁虎Gekko swinhonis 825 bp atgtttaccc agtgggcaca atgttatcgt cttgtaccac actgctacta atcttgcaca atcaatttta attaattacc ttaacactac gaagtatata cggctacatg gttgatttct gcactgagct aacagcccat ttataattgg cttctcgctt tgcgggcgca tcaccacctg gccgtactac attctttgac ttttaattct gggatagtct ctcaacaaac tgttaattcg gcattcgtaa cgcacccgat cttccggagt tcagttgacc cattaatata tcttacttgc cctgcggggg tcccggattc gggct cataaagaca cgcggagtta taattttttt atggcttttc tgaagcaggt tagttatttt aaatctactg cctaccggtt gcggagatcc ggcatagtat ttggcaccct agccagcctg tatagtcatg cacgaatgaa gctggaaccg ctctctacat ccatgtcgca ctggctgccg tgtactatat cgcatatcat atatttactg gggcactact cccgttataa taatataagt gttgaactgt ttggcaggtg gtacaatacg gaattactat caacacctat tacgtactat tttggtgtat aggggatgat ttggcggctt ttttgactgc ctatccccca tatcttcaat cccctattta acttctaacc tctgattttt gcaggaaaaa gagccggcat cagatctata cggcaattga tcccaccatc ttagcagcta cttaggggct tttgatcggt gaccgcaacc tgggcaccca aagaaccgtt cctttccacc ccagta