玉米品种纯度及真实性 SSR分子检测方法 SSR-based Method to Assay Pu rity and Genuineness in Zea mays L. ICS 65.020.20 B 21 备案号：21532-2007 北 京 市 地 方 标 准DB DB11/T 507 —2007 2007-11-22 发布 2008-02-01 实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 507—2007 I 前 言 本标准的附录 A 为规范性附录，附录 B 为资料性附录。 本标准由北京市农业局提出。 本标准由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。 本标准起草单位：北京市种子管理站、北京市农林科学院玉米研究中心、全国农业技术推广服务中心。 本标准主要起草人：贾希海、郭景伦、辛景树、律宝春、田雷、吴明生、赵久然、王凤格、云晓敏、 郭慧杰。 DB11/T 507—2007 1 玉米品种纯度及真实性 SSR 分子检测方法 1 范围 本标准依据 SSR分子标记原理，规定了进行玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方 法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。 本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 品种纯度 varietal p urity 品种在 DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的 百分率表示。 2.2 品种真实性 varietal genuineness 供检品种与标准品种的符合程度。 2.3 SSR分子标记 simple sequ ence repeat marker 由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。 2.4 引物 primer 结合在模板 DNA上的互补短链，提供 3＇-OH末端作为 DNA合成的起点，延伸合成模板 DNA的 互补链。 3 原理 在玉米基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列， 品种间因其重复次数不同 而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行 PCR 扩增，从而检测出特定 SSR 位点的多态性，以鉴别品种的纯度及真实性。 4 仪器设备及试剂 4.1 仪器设备 PCR 扩增仪；DNA 序列分析电泳槽；高压电泳仪（300 0V, 400mA , 400W）；电子天平（感量 0.01g, 0.001g）；冰箱；微量加样器（0.5 µL～10 µL, 20 µL～200 µL, 100 µL～1000 µL）；磁力搅拌器；胶片观 察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。 烧杯；镊子；刻刀；量筒；容量瓶（500mL，1000mL） ；离心管（0.5mL，1.5mL） ；吸头(10 µL，200 µL， 1000µL)；注射器（100mL） ；96 孔深孔板；96孔 PCR 板；封板膜；一次性手套；离心管架；染色盒（55cm ×38cm×8cm） ；水平仪；夹子等。 4.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris） ；盐酸（HCl，36%） ；氢氧化钠(NaOH)； 10倍PCR 缓冲液（不含Mg2+），保存条件为-20℃；氯化镁（MgCl 2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs） ，保 存条件为-20℃；TaqDNA聚合酶（5U/ µL），保存条件为-20℃；SSR 引物，保存条件为-20℃；矿物油； DB11/T 507—2007 2 去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青 FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；尿素；亲和硅烷（Binding Silane）；剥离硅烷（Repel Silane） ；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛 溶液等。 DNA 提试剂、PCR 反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录 A执行。 5 引物筛选 适宜引物筛选应遵守扩增后的杂交种 SSR电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的原 则。 可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子 10粒及父 母本种子各 5粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。 常见适用于玉米品种的纯度及真实性分析的 SSR引物名称及序列参见附录 B。 6 方法步骤 6.1 DNA提取 剥取种胚，分别放入 96 孔深孔板中。每孔加入 150 µL DNA 提取液，盖封板膜，煮沸 5min 后，在 每孔中加入 150 µL TE 缓冲液，形成样品 DNA 溶液。 样品 DNA 溶液可以直接进行 PCR 扩增或在冰箱中冷冻长期保存。 6.2 扩增 取 96 孔 PCR 反应板一块，每孔中依次加入 13.5 μL 超纯水、2 μL 10 倍 PCR 缓冲液、2.5 μL MgCl 2 （25 mmol/L）、1.2μL dNTP(2.5 mmol/L)、 0.25μL SSR引物 （20 μmol/L）、0.25μL TaqDNA 聚合酶(5U/ μL)， 混匀。 每孔再加入 2 μL 样品 DNA 溶液和 1 滴矿物油，盖封板膜后放入 PCR 仪，扩增程序为：94℃预变性 5min；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循环35 次；72℃延伸5min；4℃保存。 6.3 检测 6.3.1 胶板制作 将玻璃板洗净，用无水乙醇擦洗两遍，干燥。在长玻璃板上涂 0.5%亲 和硅烷（Binding Silane） 0.5mL，带凹槽的玻璃板上涂 2.0%剥离硅烷（Repel Silane）0.5mL。操作过程中防止两块玻璃板互相 污染。待玻璃板彻底干燥后，将长玻璃板水平放置，在玻璃板上面垂直方向两边放置边条，并与玻璃边缘对齐，然后，将带凹槽的玻璃板放在长玻璃板的上面，四周对齐，并在有边条的两边用夹子固定，水平仪调平。 吸取 4.5%PA胶 80mL，加入四甲基乙二胺 80 μL 和 25%过硫酸铵 80 μL，迅速摇匀。在凹槽一端，沿 灌胶口一边轻轻敲打，一边将胶灌进，灌胶过程中防止出现气泡。待胶流动到另一端，在凹槽一端，将梳子齿向外，轻轻的插入梳子，使其聚合 1h 以上。 6.3.2 预电泳 在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）中分别加入 1 倍 TBE 缓冲液 600ml，拔出梳子，90W 恒功率预 电泳15 min～20 min。 6.3.3 点样 20μl PCR 扩增样品加入 4 μl 6 倍加样缓冲液，混匀后，在 PCR 仪上变性：95℃变性5 min，4℃冷 却 10 min。用吸球吹吸加样槽,清除气泡和残胶，插入样品梳子，每一个加样孔点入 5 μl 样品。 6.3.4 电泳 80W 恒功率电泳 30 min。 6.3.5 染色 电泳结束后，分开两块玻璃板。将带凝胶的玻璃板浸入固定液中轻轻晃动 3min，再放入去离子水 中漂洗 10s，然后将胶板放入染色液中染色 5min。